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Dec 09, 2023

Detecção de citomegalovírus (CMV) por PCR digital em amostras de fezes para

Jornal de Virologia

Virology Journal volume 19, Número do artigo: 183 (2022) Citar este artigo

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A gastroenterite por CMV é comum em pacientes que recebem transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas e é difícil diferenciá-la da doença aguda do enxerto contra o hospedeiro (aGvHD), que apresenta sintomas muito semelhantes, mas requer tratamento bastante diferente. A gastroenterite por CMV é causada por infecção local ou reativação de CMV no trato gastrointestinal, enquanto aGvHD é causada por rejeição imune. O padrão-ouro do diagnóstico de gastroenterite por CMV e aGvHD é a biópsia gastrointestinal sob endoscopia, que é invasiva e pode potencialmente levar a efeitos colaterais graves. O teste de amostras de fezes com reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) pode ser uma alternativa, enquanto a aplicação em medições de nível de traços e precisão não são suficientemente satisfatórias nas pesquisas relatadas.

Neste estudo, projetamos um novo método que extraiu o DNA livre de células (cfDNA) do sobrenadante fecal para realizar PCR digital (dPCR) para a detecção de CMV, analisamos o desempenho e comparamos com o DNA total extraído pelo procedimento atual .

Vinte e duas amostras de fezes pareadas usando dois métodos de extração de DNA provaram que o método de extração de cfDNA tinha concentrações de DNA marcadamente mais altas e número de cópias do gene de controle, sugerindo que o cfDNA pode ser mais informativo e mais útil para a detecção do segmento de DNA do CMV. A abordagem dPCR na detecção do segmento de DNA do CMV também apresenta boa linearidade (R2 = 0,997) e maior sensibilidade (o limite de detecção a 50% foi de 3,534 cópias/μL). Oitenta e duas amostras de fezes de 44 pacientes imunocomprometidos foram analisadas, a taxa de positividade para CMV foi de 28%, indicando que mais de um quarto dos sintomas gastrointestinais nesses pacientes podem ser causados ​​por infecção ou reativação por CMV.

Os resultados combinados sugerem que a detecção de CMV por dPCR em cfDNA de sobrenadante de fezes é um método poderoso para identificar gastroenterite por CMV e ajuda na tomada de decisões de tratamento clínico.

Sintomas gastrointestinais são comuns em pacientes imunocomprometidos, como aqueles recebendo alo-HSCT, causados ​​provavelmente por gastroenterite por CMV [1] e/ou aGvHD gastrointestinal [2]. O padrão-ouro para o diagnóstico de gastroenterite por CMV ou aGvHD gastrointestinal é a biópsia gastrointestinal, que é um procedimento invasivo e pode potencialmente levar a efeitos colaterais graves, como sangramento gastrointestinal ou perfuração [3, 4]. Métodos não invasivos, como a detecção de segmento de DNA de CMV por qPCR a partir de amostras de fezes de pacientes imunocomprometidos, são considerados uma substituição potencial para a biópsia gastrointestinal [5]. No entanto, nenhum consenso bem reconhecido foi alcançado sobre o poder diagnóstico da detecção do segmento de DNA do CMV em amostras de fezes para gastroenterite por CMV. Vários estudos revelaram que testes de fezes baseados em PCR para a detecção de segmento de DNA de CMV foram valiosos no diagnóstico de gastroenterite por CMV [6,7,8] ou pelo menos para descartá-la [5, 9]. Outros estudos sugeriram que a detecção de CMV nas fezes era um preditor não qualificado de enterite por CMV [10, 11]. É importante observar que o procedimento de extração de DNA pode ter um impacto crítico na detecção de CMV em amostras de fezes. Primeiro, as amostras de fezes são matrizes complexas com diferentes componentes, que podem interferir na extração de DNA e na reação de PCR [12]. Em segundo lugar, o procedimento de extração de DNA determina se o principal tipo de DNA do produto é DNA total ou cfDNA, o que não foi totalmente considerado em relação às diferenças na detecção do segmento de DNA do CMV.

Diferente do DNA genômico (gDNA), o cfDNA existe amplamente em todos os fluidos corporais, como soro, urina e sobrenadante de fezes. Muitos avanços impressionantes na pesquisa de cfDNA foram alcançados nos últimos anos, especialmente no campo do diagnóstico precoce de câncer não invasivo e triagem pré-natal [13]. O sequenciamento de cfDNA também foi utilizado para monitorar infecção e/ou rejeição após transplante pulmonar e teve boa consistência com os resultados clínicos [14]. No entanto, a detecção do segmento de DNA de CMV em cfDNA extraído de amostras de fezes para o diagnóstico de infecção/reativação de CMV intestinal não foi bem estudada até o momento.